BB娱乐平台登录艾弗森山东中医药大学： 整合生物信息学与实验验证解析黄芪

　　原发性肝癌是我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，其中约90%为肝细胞癌[1]。肝癌的发生、发展机制复杂，涉及多个原癌基因以及信号通路[2]。近年来，中药在肝癌的预防、控制转移与复发等方面所具有的优势，使其成为抗肝癌新药研发的热点和方向[3-5]。目前中医药界对于肝癌的理论及治疗研究逐渐增多，并形成了较为统一的认识，其病机在于气虚血瘀，其治法以益气活血为主[6]。黄芪-莪术是益气活血法代表性药对，源于张锡纯所著《医学衷中参西录》中的理冲汤，主治气虚血瘀证[7]。从中医理论讲，黄芪味甘性微温，可补气升阳，为“补中益气之要药”[8]；莪术辛散苦泄，能破血散瘀，又能行气化积，是“破血化瘀之重药”[9]；两药配伍使用“破中有补，补中有行，相得益彰”从而达到“补而不滞”之效，为益气活血配伍的典型代表[10]。孙桂芝教授擅用桃红芪术软肝煎起益气活血之效，认为黄芪-莪术配伍治疗肝癌时能够补脾胃、破癥消积，对肝癌有很好的抑制作用，在临床实践中运用此法与化疗联合使用，能够明显改善肝癌患者的生存质量，在提高肝癌远期疗效上具有一定优势[11-13]。黄芪-莪术药对配伍治疗肝癌的作用确切，在抗肝癌中药中具有重要地位，但是黄芪-莪术药对抗肝癌的配伍机制尚不明确。本研究整合生物信息学与网络药理学预测黄芪-莪术药对治疗肝癌的相关靶点和通路，将筛选得到的核心成分与靶点进行分子对接，探究黄芪-莪术药对的多成分、多靶点、多通路的配伍协同作用机制，并采用体外细胞实验对核心成分和靶点进行验证。系统研究黄芪-莪术药对抗肝癌配伍机制，不仅可为含有该药对的抗肝癌系列类方的研究提供参考，而且有利于指导中医临床的合理用药，同时为该类方的质量控制和新药研发提供重要的科学依据，为肝癌这一发病率日趋升高、严重威胁人类健康的重大疑难疾病治疗做出贡献。

　　2.1.3 黄芪、莪术化学成分收集及潜在活性成分筛选 在 TCMSP （ ）数据库中对黄芪、莪术成分进行检索；将口服生物利用度（ oral bioavailability ， OB ）≥ 30% 、药物相似性（ drug-likeness ， DL ）≥ 0.18 的成分作为潜在活性成分，并结合文献报道，将具有体内外抗癌活性的黄芪、莪术成分补充到潜在活性成分中 [20-21] 。

　　2.1.4 黄芪、莪术活性成分靶点预测与抗肝癌靶点筛选 在 PubChem （ ）数据库中检索“ 2.1.3 ”项下活性成分的 Isomeric SMILES 数据，将该数据输入 SEA （ ）和 SwissTargetPrediction （ ） 2 个数据库，预测成分靶点，与 TCMSP 数据库中的靶点取并集得到潜在活性成分作用靶点，并在 Uniprot 数据库中对靶点基因名称进行校正，使蛋白质靶点信息标准化 [22] 。将成分作用靶点与“ 2.1.1 ”项下所筛选肝癌靶点取交集，得到黄芪、莪术抗肝癌靶点。

　　2.1.5 黄芪、莪术抗肝癌关键成分筛选 将“ 2.1.4 ”项下潜在活性成分靶点与“ 2.1.2 ”项下所筛选肝癌关键靶点取交集，采取疾病关键靶点“反向钩钓”关键潜在活性成分的方式，得到黄芪、莪术抗肝癌关键成分及其靶点。

　　2.1.7 拓扑网络构建与分析 采用 Cytoscape （ version 3.9.1 ）软件构建肝癌关键靶点的 PPI 网络、成分 - 靶点网络、关键成分 - 靶点 - 通路网络。通过 Network Analyzer 插件对关键成分 - 靶点 - 通路网络的拓扑性质进行分析，获取成分、靶点、通路相关介数值。

　　2.1.8 黄芪、莪术抗肝癌核心成分及其抗肝癌核心靶点筛选 通过 1 种网络贡献指数（ CI ）评价黄芪 - 莪术抗肝癌成分发挥抗肝癌作用的贡献大小 [24] 。

　　i 为成分的数量； j 为靶点的数量； ωei 为网络节点参数； Aij 为根据 ωei 值确定的亲和力指数； CAi 为黄芪关键成分 - 靶点 - 通路网络中每种抗肝癌成分的介数； CBi 为莪术关键成分 - 靶点 - 通路网络中每种抗肝癌成分的介数， Ci 为每种抗肝癌成分的介数； Pj 为每种靶点的介数，以参数由关键成分 - 靶点 - 通路网络中获得； NEi 为网络中 1 种抗肝癌成分的网络贡献； CI 为抗肝癌成分发挥抗肝癌作用的贡献大小

　　以“ hepatocellular carcinoma ”和“ liver cancer ”及活性成分的常用名称用作为关键词，检索 1990 — 2018 年出版于 PubMed 和 CNKI 数据库中的相关文献。如果前 N 个成分的 CI 总和超过 50% ，则认为这些相关的 N 个成分对黄芪和莪术发挥抗肝癌作用的贡献最大； CI 总和超过 90% ，则认为这些相关的 N 个成分对黄芪和莪术发挥抗肝癌作用的贡献最主要。核心成分在关键成分 - 靶点 - 通路网络中所调节的介数大于 5 的靶点为抗肝癌核心靶点。

　　2.1.10 核心基因在肿瘤及正常组织表达量差异分析 在癌症基因组图谱（ cancer genome atlas ， TCGA ）网站中得到核心基因在肿瘤组织及正常组织中的表达量，进行差异表达分析 [25] 。

　　2.2.1 MTT 实验 将处于对数生长期的 HepG2 和 LO2 细胞分别以 5 000 个 / 孔接种到 96 孔板中，培养 24 h 后，分别给予不同浓度的黄芪皂苷 II 、黄芪甲苷、芒柄花素、莪术醇、姜黄素、双去甲氧基姜黄素，对照组加入不含药物的培养基，同时设置调零孔（不接种细胞），处理 24 、 48 、 72 h ，处理后每孔加入 10 μL MTT （ 5 mg/mL ）， 37 ℃孵育 4 h ；去上清，加入 100 μL DMSO 终止孵育，使用酶标仪测定 570 nm 处的吸光度（ A ）值，计算细胞存活率 。

　　2.2.2 药物协同作用研究 根据“ 2.2.1 ”项结果，从黄芪、莪术各成分中各选 1 个作用效果最佳的单体，进行药物协同作用研究。细胞存活率的结果通过 Chou-Talalay 模型进行分析，以评价黄芪 - 莪术成分配伍的协同作用，明确最佳协同剂量， CompuSyn 软件采用 Chou-Talalay 模型计算药物组合的组合指数，组合指数＝ 1 为加和效应，组合指数＜ 1 为协同作用，组合指数＞ 1 为拮抗作用 [24] 。

　　2.2. 4 Western blotting 法检测蛋白表达 选择“ 2.2.2 ”项单体对应的靶点在 Pymol 软件中进行分子对接可视化，并通过 Western blotting 实验验证单体对蛋白表达的影响。分组与给药同“ 2.2.3 ”项，收集药物作用后的 HepG2 细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，使用 Nanodrop lite 检测蛋白浓度，蛋白样品经 10% 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至 PVDF 膜，经 5% 脱脂奶粉封闭后，加入一抗， 4 ℃孵育过夜；加入二抗， 37 ℃孵育 2 h ，使用 ECL 化学发光试剂盒显影，采用 Image J 软件分析条带灰度值。

　　2.2. 5 统计学分析 数据使用 Graphpad Prism 9.5 软件处理，采用单因素方差分析进行组间统计。

　　对 GSE57957 、 GSE60502 、 GSE84402 肝癌基因表达数据进行 PCA ，结果显示在 3 个数据集中，肝癌组织与癌旁组织基因表达均能明显区分（图 1-A ～ C ）；进一步 Limma 分析，结果显示在 3 组数据中 DEGs 分别有 353 个（上调 85 个，下调 268 个）、 1 241 个（上调 575 个，下调 666 个）、 1 689 个（上调 1 031 个，下调 658 个，图 1-D ～ F ）；将以上 3 组数据中的 DEGs 取并集，共得到肝癌靶点 2 766 个（图 1-G ）；进一步疾病关键靶点分析，结果显示 PPI 网络中得分最大为 97.33 的 MCODE 功能模块所含有的 112 个靶点为肝癌关键靶点（图 1-H ）。

　　通过检索 TCMIP 数据库，得到黄芪化学成分 87 种，经筛选潜在活性成分 26 种，其中 OB ≥ 30% 、 DL ≥ 0.18 的成分 20 种（ AR-1 ～ AR-20 ），通过文献补充的成分 6 种（ AR-21 ～ AR-26 ）；得到莪术化学成分 81 种，经筛选潜在活性成分 13 种，其 中 OB ≥ 30% 、 DL ≥ 0.18 的成分 3 种（ CR-1 ～ CR-3 ），通过文献补充的成分 10 种（ CR-4 ～ CR-13 ），黄芪与莪术共有成分 1 种（常春藤皂苷元），共得到黄芪 - 莪术药对潜在活性成分 38 种（表 1 ）。

　　分别对黄芪 166 个靶点、莪术 103 个靶点进行 KEGG 富集分析，根据包含靶点数量筛选排名前 20 的通路，结果显示，黄芪与莪术所调节的 20 条通路中，共有通路有 9 条；其中黄芪中排名前 5 位的通路分别为代谢途径、癌症的通路、神经活性配体 - 受 体相互作用、磷脂酰肌醇 3- 激酶（ phosphatidylinositol 3-kinase ， PI3K ） - 蛋白激酶 B （ protein kinase B ， Akt ）信号通路、细胞周期，莪术中排名前 5 位的通路分别为代谢途径、癌症的通路、类固醇激素生物合成、胆汁分泌、化学致癌（图 2-B ）。

　　通过肝癌关键靶点进行“反向钩钓”，得到黄芪 - 莪术抗肝癌关键成分 29 种，其中黄芪抗肝癌关键成分 22 种、莪术抗肝癌关键成分 8 种，两者共有抗肝癌关键成分 1 种（常春藤皂苷元，图 3-A ）。 29 种黄芪 - 莪术抗肝癌关键成分所调节抗肝癌关键靶点 15 个，对以上靶点进行 KEGG 富集分析，共得到 17 条通。